科技前沿

环状RNA研究新突破，陈玲玲/杨力/李劲松等开发基于Cas13的功能性circRNA筛选工具

日期：2020-12-08　　浏览次数：10556

来源：Bio生物世界


1976年，德国科学家 HeinzL. Sanger 等人首次发现了circRNA分子，在经过30多年的沉寂后，circRNA在2013年一鸣惊人，并在随后几年时间里迅速成为新一代明星分子。

环状RNA（circRNA），是一类非编码RNA，其特征在于3'和5'末端通过反向剪接形成共价连接。circRNA长期以来一直被认为是mRNA剪接过程的副产物，没有特定功能。但近年来，人们在真菌、原生生物、植物、果蝇、小鼠以及人类细胞中发现了许多circRNA。越来越多的研究表明，circRNA并非mRNA剪接的副产物，而是在细胞中发挥重要作用的一类RNA分子。

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组长期从事长非编码RNA（包括LncRNA和circRNA）生物学研究，发表了一系列长非编码RNA重要研究成果。

2020年12月7日，陈玲玲、杨力、李劲松团队合作，在 Nature Methods 杂志发表了题为：Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system 的研究论文。该研究于2020年3月25日在预印本 bioRxiv 提前上线。

该研究开发了CRISPR–RfxCas13d，通过gRNA靶向circRNA的反向剪接位点（BSJ），可有效区分circRNA与线性mRNA。基于该技术，研究团队构建了靶向人类高表达circRNA的反向剪接位点序列的慢病毒文库，使用该筛选文库，研究团队发现了一组对细胞生长、胚胎发育等有重要作用的功能性circRNA。

该研究开发了一种基于CRISPR-Cas13d的筛选工具，能够快速筛选和发现功能性circRNA。


CRISPR-Cas9基因编辑技术自2013年以来，由于强大的DNA编辑能力而备受关注，更是在今年荣获诺贝尔化学奖。

2013年2月，张锋团队首先将CRISPR-Cas9基因编辑技术成功应用于哺乳动物和人类细胞，成功编辑DNA。2016年8月，张锋团队发现并证实Cas13a能够靶向切割RNA。

而此后发现的Cas13d，具有更高的效率、更低的脱靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成员具有更小的尺寸，能够更容易包装到病毒载体中，因此具有更好的递送优势和应用前景。

circRNA通常由编码基因的外显子部分反向剪接而来，但由于缺乏区分circRNA与其同源外显子mRNA的适当方法，目前对特定circRNA的功能仍然知之甚少。

CRISPR-Cas13系统，能否通过gRNA靶向circRNA的反向剪接位点（BSJ）来区分circRNA和其同源线性mRNA尚未可知。

研究团队分别验证了LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、RfxCas13d 对特定circRNA敲低效果，试验结果表明，RfxCas13d对circRNA的敲低效率最高，且对应的线性mRNA几乎不受影响。



接下来，研究团队构建了靶向人类细胞中高表达的circRNA的BSJ-gRNA文库，并在HT29、HeLa、293FT及H9细胞系中进行功能丧失筛选，并对筛选到的circRNA进行单独功能验证，结果表现一致。表明使用RfxCas13d/BSJ-gRNA进行人类细胞功能性circRNA筛选是可行的。



使用该筛选工具，研究团队发现了一组对细胞生长非常重要的circRNA，其中，circFAM120A通过阻止FAM120A的mRNA与翻译抑制剂IGF2BP2的结合，促进FAM120A表达，在体内和体外增强细胞增殖，起到癌基因的作用。

该筛选工具同样能够有效、稳定地干扰小鼠胚胎中的circRNA表达，而不影响对应的线性mRNA，研究团队使用该筛选工具发现了对小鼠胚胎植入前发育非常重要的circMan1a2，这也表明circRNA在动物早期发育中还有我们未知的功能。

该方法可以在在不影响其母基因mRNA表达的情况下，构建circRNA功能丧失的小鼠模型，这将是证明内源circRNA生理重要性的必要条件。

总的来说，该研究开发了一种基于CRISPR-Cas13d的筛选工具，能够在个体和大规模水平快速筛选和发现功能性circRNA。

据悉，中科院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲组李斯琪博士、李响博士、中科院上海营养与健康研究所（中科院-马普学会计算生物学伙伴研究所）杨力组薛尉博士生和中科院分子细胞科学卓越创新中心李劲松组张麟博士生为共同第一作者，陈玲玲研究员、杨力研究员和李劲松研究员为该论文的共同通讯作者。

论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41592-020-01011-4