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PIBB|青蒿素分子结构测定40周年: 听亲历者讲那过去的事情

日期:2017-01-21  浏览次数:2055

屠呦呦因在青蒿素治疗疟疾方面的贡献荣获了2015年诺贝尔生理或医学奖,这是中国科学家首次获此殊荣,举国为之欢腾。在一种新药的认定过程中,测定其精确的立体结构(即组成原子的三维结构和具有药物活性的构型)是一个不可或缺的重要环节,青蒿素也不例外。只有测定了青蒿素的立体结构,才能正确解释其抗疟功能,从而为定向设计高效低毒的抗疟药物提供依据。

在1960年代的越南战场上,疟疾横行,因此中国于1967年成立了523任务办公室,先后召集了60多个科研单位、500多名科研人员参与抗疟药物的研究。1970年代青蒿素分子结构测定这一重要任务被下达到中国科学院生物物理研究所(以下简称生物物理所),因为该研究所是全国唯一拥有X射线四圆衍射仪的单位,并且因参与胰岛素晶体结构的测定已拥有一批适合的研究人才。生物物理所的研究团队不辱使命,经过艰辛地探索与创新,终于确定了青蒿素分子的化学和三维结构[1]及其具有活性的绝对构型[2]。

第一篇关于青蒿素立体结构的文章[1]于1977年发表在《科学通报》上,题为“一种新型倍半萜内酯—青蒿素”。值此重要的学术成果报道40周年之际,《生物化学与生物物理进展》(Progress in Biochemistry and Biophysics, PIBB)组织了“青蒿素分子结构测定首报40周年纪念专题”。专题邀请了当时亲历此项工作的梁丽教授撰文[3]重温这一段研究历史。该专题还邀请了熟悉这一时期的结构生物学家华庆新教授,阐释“X射线晶体衍射是解析出青蒿素三维结构的唯一方法”[4],并澄清了目前媒体及网络上流传的关于青蒿素结构是由波谱学数据解读出来的错误说法[5]。

梁丽教授在她题为“青蒿素分子和立体结构测定的历史回顾”一文[3]中,首先简要回顾了抗疟药青蒿素的获得:研究小分队从两方面着手,即寻找化学抗疟药和筛选中草药。其中,军事医学科学院(以下简称军科院)和卫生部中医研究院中药研究所(以下简称北京中药所)合作,经水煎、醇提后送军医科院鼠疟模式系统测试,在筛选近百个药(方)后,北京中药所于1971-1972年发现青蒿提取物有一定的抗疟作用,但是不稳定。1973年云南省药物研究所和山东省中医药研究所分别从大头黄花蒿和黄花蒿中,拿到了黄蒿素(1978年扬州鉴定会决定此后称为青蒿素)的结晶,其抗疟结果令人振奋。这两家单位随后创立了工业分离提纯青蒿素的流程,并提供数十克青蒿素给北京中药所。

1973年中国医学科学院药物所测定了青蒿素的成分,并推算其分子式。1974年中科院上海有机化学所进一步确定了青蒿素的分子式,并获得了青蒿素分子的若干片段,但由于当时波谱和化学反应的局限性,不能得到唯一客观的结果。因此,梁晓天教授等促成523办公室将青蒿素结构测定的工作交给生物物理所,由北京中药所提供青蒿素单晶。

国内首次应用直接法,解决晶体学中的相角问题,确定青蒿素的化学结构

青蒿素化学结构的确定比较有难度,是因为青蒿素(C15H22O5)不含重原子,而当时国内常规采用的是重原子方法来解决单晶分析中棘手的相角问题。生物物理所胰岛素晶体结构室李鹏飞课题组在阅读了大量国外文献后,决定采用国外刚刚兴起的直接法[6]来解决这一难题。由于国内没有大型计算机,在众多直接法中,他们采用唯一可行的Karle夫妇[7]的符号附加法。那个时期的研究人员所学的基本是俄文,他们对照英文词典去研究直接法的数理统计原理。研究组没有计算机,李鹏飞和梁丽到北京计算中心(TQ-16机组),利用他人不用的时段(半夜)进行演算。没有计算机程序,他们二人就学习编程语言,自己编制了计算程序。从简略甚至是模糊的参考文献中去琢磨方法,然后通过上机计算检验对方法的理解是否正确。在这样简陋的条件下,他们仅用了7个月的时间,就掌握了直接法,确定了青蒿素的化学结构。


青蒿素分子的三维结构(科学通报,1977)

在1975年的全国523工作北京会议上,梁丽报告了青蒿素的化学结构,展示了三维分子图像,大会与会者都欢欣鼓舞。这个结构与上海有机所所推测的分子骨架截然不同,大会后召开了由梁晓天教授主持的鉴定会,否定了上海有机所根据光谱和化学反应所推测的一个过氧内酯的结构(根据实验数据排列出十数个可能的分子结构式),确认了生物物理所用X射线晶体衍射方法得出的青蒿素分子结构,称其具有合理的化学键,能解释所有观测到的实验,并建议将这一结果发表。后来梁丽和中科院化学所朱秀昌先生(高分子研究的开拓者之一)一起排定了青蒿素分子中的原子序号,查遍文献后才发现是一种新型倍半萜内酯,起草了题为“一种新型倍半萜内酯—青蒿素”的论文。该文发表于《科学通报》1977年第3期,并于当年被《化学文摘》收录,这是有关青蒿素结构的第一篇科学报道。

引进最小二乘方法,获得首个精细晶体结构

青蒿素分子的三维结构被解析后,还需要明辨构型。因为只有把生物活性和构型联系起来,才能从原子水平上理解青蒿素和靶分子的作用。测定绝对构型首先要得到精细结构,但是以前国内单晶X 射线衍射都是目测强度,实验误差大,不可能得到精细结构。通过查阅国外文献,研究人员引进了最小二乘方法。不幸的是,在此期间(1976年初冬)李鹏飞在机房病倒,后因肾功能衰竭而英年早逝。梁丽继续推进了最小二乘修正方法的建立,并把它成功地应用在这个课题上,完成了青蒿素化学结构的精细测定,使得青蒿素结构精度达到了国际先进水平。


最小二乘方法修正后青蒿素分子的精细结构(左为键长,右为键角;中国科学,1979)

利用X射线反常散射,确定青蒿素分子的绝对构型

青蒿素是旋光异构体,因此其绝对构型的信息对于合成活性青蒿素至关重要。常规的X射线衍射实验数据不能分辨与活性化合物的分子性质相关联的绝对构型,因此生物物理所青蒿素协作组引进了X射线反常散射方法。青蒿素只含轻原子,反常散射效应很微弱,他们为此设计了一个比较费时但能更精确反复累积衍射强度的数据收集方式,以实现这些反常散射信息的最大化。经过繁琐的计算,确定了青蒿素分子的绝对构型,这也是国内用X射线反常散射方法成功测定的第一个不含重原子的天然产物的绝对构型。


绝对构型的青蒿素分子结构模型(中国科学,1979)

1978年4月,由梁丽执笔、署名中国科学院生物物理所青蒿素研究组的论文“青蒿素晶体结构和绝对构型”完稿,该文发表在《中国科学》[2](中文版1979年,英文版1980年),于1980年被《化学文摘》收录,并且被编入周公度教授的《结构和物性》高等教育课程教材。

生物物理所X射线晶体衍射所测定的青蒿素立体结构被国内外认可

1978年8月在华沙召开的第11届国际晶体学大会上,生物物理所的代表展示了青蒿素的立体结构模型;1979年生物物理所因青蒿素结构的测定荣获国家发明二等奖;在1981年召开的世界卫生组织化学专业组第四次北京国际会议上,屠呦呦报告了青蒿素的立体结构,生物物理所代表应邀参会。屠呦呦在她的书中写道“用当时国内先进的X-衍射方法测定青蒿素的化学结构,并在精细地测定反常散射强度数据基础上确定其绝对构型,终于在1975年11月30日确定了青蒿素的化学结构”。Daniel L. Klayman1985年在Science[8]发表的综述中也明确指出,青蒿素的结构以及它的相对构型是由X射线衍射测定的,它的绝对构型也已经查明。

生物物理所青蒿素研究团队从原子水平揭示的青蒿素分子的立体结构和活性构型,使人们确信抗疟新药青蒿素的发现,为青蒿素抗疟研究获得诺贝尔奖奠定了科学基础,青蒿素这一立体结构被列在2015年诺贝尔生理或医学奖发布文献中[9]。


青蒿素的立体结构被列在2015年“诺贝尔生理或医学奖”Press Release

梁丽教授关于青蒿素结构某些学术问题的校正与澄清

梁丽教授在文中不仅详细回顾了测定青蒿素结构和构型的全历程,也希望借此机会校正某些混淆的学术和认知问题,以供后来人借鉴。

《科学通报》“一种新型的倍半萜内酯—青蒿素”一文中,掺杂了不同的测试方法和科学概念,容易使读者忽略文章的重点所在。该文的首稿由梁丽执笔,集体署名 “青蒿素结构研究协作组”和投稿期刊事宜由课题组长李鹏飞拟定,稿件于1976年1月中旬完成。在原稿中仅包含了根据X射线晶体衍射发现一种新型倍半萜内酯这一内容,文中附有手绘的三维青蒿素化学分子结构,以及含分子结构骨架的电子云密度叠合图。当时的合作单位北京中药所(提供X射线衍射实验所需的单晶样品)不太了解这些数据(“生物物理所那些数据我们也不懂,…”[10]),但却在生物物理所的原稿上作了修改,插入了其他不能测定晶体结构的方法,并混淆了结构和构型的科学概念(修改为“根据光谱数据和X射线分析以及化学反应,证明其为一种新型的倍半萜内酯,具有左列的相对构型”)。这些修改未经生物物理所最后审阅,便上报了卫生部,并体现在《科学通报》的论文中。


《科学通报》青蒿素结构文章(1977)

文章发表后当年即被《化学文摘》收录,《化学文摘》的专业编辑从X射线衍射的两张图,断定出测定的是1(青蒿素)的晶体结构,而不是不确切的“相对构型”(relativeconfiguration),因此恢复了原稿中“结构”(structure)这一科学表述,而对后来插入的“光谱数据以及化学反应”做了保留,分别摘出为“The structure was detd. by mass spectrometry,IR spectrometry,1H NMR,and chem. reactions. The cryst. structure of 1 was also detd.”梁教授在文中说:“众所周知,只有X射线衍射方法才有可能测定像青蒿素这样前所未见的复杂立体结构,而20世纪70年代的波谱和化学反应却无能为力。”

梁丽教授在文章末尾特别致敬梁晓天先生,认为他以科学数据为本,不因生物物理所年轻人作出的青蒿素结构而看轻,也不管上海有机所提出结构推测的是什么人,以广博的化学和波谱知识,对青蒿素结构的正确认定起到了重要作用。

40年弹指一挥间,回望是一个很好激励与借鉴,也是对那些参与者、那段岁月的一个致敬。

参考文献:
[1] 青蒿素结构研究协作组. 一种新型倍半萜内酯—青蒿素. 科学通报, 1977, 22(3): 142
[2] 中国科学院生物物理研究所青蒿素协作组. 青蒿素的晶体结构及其绝对构型. 中国科学, 1979(11): 1114-1128
[3] 梁丽.青蒿素分子和立体结构测定的历史回顾. 生物化学与生物物理进展, 2017, 44(1): 6-16
[4] 华庆新. X射线晶体衍射是解析出青蒿素三维结构的唯一方法. 生物化学与生物物理进展, 2017, 44(1): 17-20
[5] 王丹红. 周维善院士讲述青蒿素结构测定经过. 科学时报, 2008-12-02(A2)
[6] 竺迺珏. 创建测定分子结构的直接法—浅谈1985年诺贝尔化学奖. 知识就是力量, 1986(1):
[7] Karle I L, Karle J. An application of the symbolic addition method to the structure ofL_arginine dihydrate. Acta Crystallographica,1964, 17(7): 835-841
[8] Klayman D L. Qinghaosu (artemisinin): an antimalarial drug from China. Science, 1985, 228(4703): 1049-1055
[9] Press Release: the 2015 Nobel Prize in Physiology or Medicine. http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2015/press.html
[10] 黎润红. “523”任务与青蒿素研发访谈录. 长沙: 湖南教育出版社, 2015: 266-286

注:感谢PIBB王海群的修改意见。