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北京大学郭雪峰/北京科技大学李立东合作开拓新的方法,为未来精确的单分子测序奠定了技术基础

日期:2023-02-07  浏览次数:7993

来源:iNature

RNA的降解过程在保证生物体内遗传信息的高保真翻译中起着决定性作用。然而,实时可视化单碱基降解过程并在单酶水平上破译降解机制仍然是巨大的挑战。


202321日,北京大学郭雪峰北京科技大学李立东共同通讯在Nature Communications在线发表题为Single-exonuclease nanocircuits reveal the RNA degradation dynamics of PNPase and demonstrate potential for RNA sequencing的研究论文,该研究表明单核酸外切酶纳米回路揭示了PNPaseRNA降解动力学,并展示了RNA测序的潜力。


该研究提出了一种可靠的基于超高时间分辨率的硅纳米线场效应晶体管的原位单PNPase分子动态电探测器。这些设备能够以单碱基分辨率实现RNA类似物降解的实时和无标记监测,包括RNA类似物结合、单核苷酸水解和单碱基移动。作者发现了酶(在活性位点附近)与核苷的结合事件,进一步理解了RNA降解机制。依靠对独立读段的系统分析,在RNA核苷测序中,大约80%的准确性在单个测试过程中实现。这一概念验证为机械探索和单分子测序的高通量检测技术的发展建立了一个互补金属氧化物半导体(CMOS)兼容的平台。


RNA降解是转录组信息传递的终点,通过对突变和片段性RNA的降解来保证遗传信息的高保真度。衰老非编码RNA的降解对维持生理环境的健康运行也起着决定性作用。全面破解RNA降解机制对于研究转录组信息传递的高保真原理细节和生理环境的精确调控规律至关重要。生物大分子系统的结构信息和动力学特性对于探索其内在机制和相应功能具有重要意义。


用于分析酶-底物催化反应过程中构象变化的宏观技术通常会产生关于样品的集体信息,这些信息可以掩盖单个酶的详细性质。为了克服这一问题,迫切需要开发能够在单分子水平上获得内在信息的方法。单分子电检测技术的出现为在单个事件水平上研究生物相互作用和化学反应提供了一种先进的方法。


外切酶以3'-to-5'-5'-to-3'方向逐步降解多核苷酸。这已经越来越多地整合到纳米纳米束、荧光共振能量转移和荧光共振能量转移等技术中,以开发高通量RNA测序策略和了解外切酶的酶促机制。然而,时间和空间分辨率的缺乏严重限制了这些技术在单碱基分辨率下破译嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)降解机制的实施。



SiNW FET的原理图和表征(图源自Nature Communications 


大肠杆菌PNPase是一种典型的同源三聚体外切酶,由两个NRNase PH结构域、两个C端结构域和KH/S1结构域组成。在磷酸的存在下,它可以催化RNA的逐步水解。为此,作者构建了基于硅纳米线场效应晶体管(SiNW FET)的单蛋白传感器,以实现检测单个大肠杆菌PNPase分子与RNA类似物之间的相互作用。该方法结合微秒时间分辨率技术,可以实时、高保真、单碱基分辨率直接揭示单分子RNA的详细降解过程。重要的是,这种方法能够有效地区分给定RNA序列中的不同核苷,从而为未来精确的单分子测序奠定了技术基础。


原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-023-36278-6