Protein ＆ Cell | 杨辉团队证明单碱基编辑可用于人胚胎保护性突变的引入

日期：2022-11-10　　浏览次数：10659

来源：BioArt

传统的CRISPR/Cas9技术会诱导双链DNA断裂（DSB），随后细胞内以同源重组（HDR）或非同源末端连接（NHEJ）两种主要路径修复断裂的DNA，进而造成基因组上碱基的插入或者缺失突变（Indel）。2020年，Dieter Egli团队报道CRISPR/Cas9系统在对EYS基因突变位点进行修复的时候会频繁的发生所在染色体的整个或者部分丢失【1】，提示利用外源模板结合HDR途径修复人类胚胎致病突变还为时尚早。最近几年，研究报道单碱基编辑工具（Base editor）可以实现C·G to T·A或A·T to G·C的转换，提供了一种相对较为安全高效的方法去诱导特定的点突变，或者去纠正由于点突变引起的人类遗传性疾病【2】。

2022年11月3日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉团队与上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院章美玲和李文研究组、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙研究组、上海交通大学医学院附属仁济医院杜艳芝研究组合作在Protein ＆ Cell发表了题为Human 8-cell embryos enable efficient induction of disease-preventive mutations without off-target effect by cytosine base editor的研究论文，该研究发现在人8细胞胚胎中可以安全高效的诱导与阿尔茨海默疾病（Alzheimer’s disease, AD）、家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH）以及系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）等疾病相关的保护性突变。

早在2019年，杨辉团队在Genome Biology上发表了题为Human cleaving embryos enable robust homozygotic nucleotide substitutions by base editors 的研究论文，证明碱基编辑器BE3和ABE7.10在2细胞和4细胞时期注射时编辑效率远高于中期II（MII）卵母细胞或者受精卵时期【3】。人类胚胎（4～8细胞阶段）的合子基因激活（ZGA）的发生通常比小鼠胚胎（2细胞阶段）晚。作者继之前的研究更加全面系统地比较了8种胞嘧啶碱基编辑器（CBE）在受精后4个时间点（1细胞、2细胞、4细胞及8细胞）人类胚胎中的编辑效果。研究结果表明FNLS-YE1在8细胞时期可以实现高效（最高可达100%）的碱基转换效率，同时具有最低的旁编辑效应。

通过深度测序、全基因组测序和全转录组测序对FNLS-YE1碱基编辑器进行全方位的脱靶评估结果显示，FNLS-YE1并未造成明显的脱靶效应，同时8-cell注射与对照组相比，没有明显的胚胎形态学和发育率上的差异。

阿尔茨海默疾病（AD）是一种较为严重和广泛的神经退行性疾病，主要表现为记忆和其他认知功能的逐渐丧失【4】。目前，还没有有效的治疗方法。大多数AD病例发生在65岁或以上，通常被称为晚发性AD。在人类中，APOE基因主要有三种亚型(APOE2 (ε2)、APOE3 (ε3)、和APOE4 (ε4))，对脂质和神经元内稳态有着不同的影响【5】。在遗传学上，APOE4（人群中的频率大约为13%）是单一的晚发型家族性和散发性AD的最大危险因素之一【5】，占到AD患者的65-70%。据统计，ε4纯合子的AD患者临床发病时的平均年龄和频率为68岁和91%，ε4杂合子分别为76岁和47%，ε4非携带者为84岁和20%【6,7】，表明APOE4可显著增加患AD的风险，并以基因剂量依赖的方式逐步降低疾病的发病年龄。与大多数人具有的等位基因APOE3相比，APOE2等位基因对患AD的风险具有保护作用，而携带一份APOE4的人患AD的风险将增加3倍，携带两份APOE4的人将增加15倍【8,9】。事实上，ε4（112R/158R；CGC/CGC）等位基因与ε3 (112C/158R或112R/158C；TGC/CGC或CGC/TGC) 等位基因，只有一个氨基酸的差异。CBE碱基编辑系统不诱导DSB产生，可以精准实现精氨酸（R）到半胱氨酸（C）的转变，从而实现等位基因ε4到ε3的改变。考虑到全世界ε4纯合子的人群较大（据估计有1.4亿），探索利用CBE系统在人胚胎上高效实现ε4到ε3基因型的转变同时保持最低的脱靶效应，对成体治疗AD具有重要的指导意义。

研究人员临床招募了一例携带APOE4等位基因的男性，知情同意（精子和所用到的临床废弃卵子捐赠者）后，通过ICSI方式获得了10枚2PN卵裂期的胚胎。其中，包括5枚ε3/ε3胚胎，4枚ε3/ε4胚胎和1枚ε4/ε4胚胎。通过FNLS-YE1注射对卵裂球进行编辑后，单卵裂球测序结果显示，在84个卵裂球中，有67（79.8%）个卵裂球中的ε3或ε4等位基因实现了C到T的转换。对于ε3/ε3胚胎，26/46（56.1%）的卵裂球变成ε2/ε2基因型，10/46（21.6%）变成ε2/ε3基因型。对于ε4/ε4的1枚胚胎，5/6 (80%)的卵裂球具有ε4到ε3r基因型的转变，其中3/6 (50%) 的卵裂球成为ε4-free的情况。在2PN胚胎中，等位基因水平上有超过60%的C>T的突变效率，其中保护性等位基因ε2从0增加到47.3%，超过一半的ε4等位基因被转变为ε3r等位基因。另外，二代测序和RNA-seq测序显示APOE基因编辑过的胚胎与对照组相比，未发现明显的脱靶现象。

此外，研究人员还探索了应用FNLS-YE1系统高效安全的在人胚胎中引入其它已知的保护性突变，以降低对FH和SLE等疾病的潜在易感性。

该研究首次探索了利用FNLS-YE1系统在人8细胞胚胎中可以高效安全引入人群中已知的保护性突变，为减少人类对AD或其他遗传性疾病的易感性提供了指导。基于CBE系统效率和特异性的提高，研究人员认为FNLS-YE1介导的疾病保护性突变可以为一些遗传疾病的成体基因治疗提供借鉴。

该项工作由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心博士后魏迎辉、胡静、周英思、薛明星，上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院魏迎辉博士、章美玲副研究员等科研人员，在中科院脑智中心杨辉研究员，国妇婴李文教授、章美玲副研究员，上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙研究员以及仁济医院杜艳芝教授的共同指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了北京大学胡家志研究员的大力协助，是众多课题组通力合作的成果。

原文链接：https://doi.org/10.1093/procel/pwac043

参考文献：

[1] Zuccaro MV, Xu J, Mitchell C et al. (2020) Allele-specific chromosome removal after Cas9 cleavage in human embryos. Cell 183:1650– 1664.

[2] Komor AC, Kim YB, Packer MS et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 2016;533:420–424.

[3] Zhang M, Zhou C, Wei Y et al. Human cleaving embryos enable robust homozygotic nucleotide substitutions by base editors. Genome Biol 2019;20:101.

[4] Huang Y, Mucke L. Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies. Cell 2012;148:1204–1222.

[5] Tanzi RE. The genetics of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a006296.

[6] Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families. Science 1993;261:921–923.

[7] Liu CC, Kanekiyo T, Xu H et al. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy. Nat Rev Neurol 2013b;9:106–118.

[8] Raber J, Huang Y, Ashford JW. ApoE genotype accounts for the vast majority of AD risk and AD pathology. Neurobiol Aging 2004;25:641–650.

[9] Smith CJ, Ashford JW, Perfetti TA. Putative survival advantages in young apolipoprotein ε4 carriers are associated with increased neural stress. J Alzheimers Dis 2019a;68:885–923.