JCB | 陈宝惠/邹炜团队开发LiveArt新技术实时监测和定量核糖体RNA生成

日期：2022-11-01　　浏览次数：10422

在人细胞内，RNA聚合酶I (Pol I)专职介导上百个拷贝的核糖体RNA基因(rDNA)的转录，合成核糖体47S rRNA，进一步剪切加工成18S、5.8S和28S rRNA。这些RNA约占细胞总RNA的60%。核糖体RNA是组装核糖体大小亚基的重要组分。因此，Pol I的转录活性控制着核糖体的生成水平和细胞增殖、生长。Pol I转录紊乱会导致癌症和其他人类疾病。然而，目前仍旧缺乏实时监测和定量Pol I活性的方法。

 

2022年10月25日，Journal of Cell Biology在线刊登了浙江大学基础医学院/良渚实验室陈宝惠研究员-转化医学研究院邹炜研究员联合团队的学术论文“Real-time imaging of RNA polymerase I activity in living human cells”。该研究开发了LiveArt（live imaging-based analysis of rDNA transcription）技术，用于实时可视化和定量单个内源rDNA位点产生rRNA的动态变化。LiveArt技术能够动态追踪细胞有丝分裂过程中rDNA转录沉默与重新激活的全过程，首次揭示了间期rDNA的转录动力学和调控规律。该研究表明LiveArt作为 Pol I转录活性的活细胞报告系统，为筛选Pol I活性的调控因子以及靶向Pol I转录的抗肿瘤药物提供了高效的平台，并为深入研究核仁功能提供了一个新的可视化方法。

基于MS2/MCP系统的RNA标记技术已经被广泛地运用于RNA聚合酶II（Pol II）活性的定量成像。然而，Pol I的实时转录动态尚未有报道。其最大的挑战在于人的基因组大约有400个rDNA拷贝，很难实现在单个内源rDNA位点上去实时检测Pol I介导的转录动态变化。该研究结合MS2/MCP系统的RNA标记方法和CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过控制编辑效率和分离单细胞克隆的方法，分别建立了新生rRNA和成熟rRNA的可视化方法。本研究结果表明：

1）LiveArt标记的rRNA定位于核仁内，其生成能被Pol I特异的抑制剂（例如CX-5461）阻断。

2）通过在3‘-ETS或ITS1区域插入MS2标签而标记的新生rRNA主要聚集于转录中心，而通过在5.8S区域插入MS2标签而标记的新生及成熟rRNA定位于核仁内的不同位点。

3）LiveArt可在单细胞水平上监测有丝分裂过程中rDNA先沉默再激活的过程。

4）LiveArt可灵敏地反应Pol I转录的上调和下调。因此，LiveArt技术可用于监测Pol I转录的实时变化。

现有的rRNA探针，例如J1，可结合核仁内所有rRNA, 其结合特异性有待提高。另外，这种标记方法无法用于对rDNA的实时转录水平进行定量。LiveArt有两个显著的优点：1）仅单个或低拷贝的rDNA所产生的rRNA被荧光标记；2）通过分离单细胞克隆可获得rRNA稳定标记的细胞株。因此，研究人员可以在不同条件下，长时间观测Pol I的转录动力学。此外，LiveArt的细胞株为筛选Pol I调控基因以及靶向Pol I的小分子药物提供了一个简单、高效的筛选平台。

本研究利用LiveArt技术进行了若干个探索：

1）通过对rDNA转录进行长达8小时的追踪，揭示了Pol I介导的rDNA转录呈现转录爆发模式(transcriptional bursting)并解析了其调控规律。

2）结合核仁结构的动态分析，发现rRNA对细胞分裂末期核仁重建以及细胞间期核仁形态的维持至关重要。

3）鉴定了SRFBP1蛋白作为调控Pol I转录的新作用。

4）完成了一个小规模的药物筛选，结果揭示LiveArt可作为高效筛选抗肿瘤小分子的新策略。

 

rRNA合成的异常增加被证明是肿瘤细胞快速增殖的重要分子基础。这一发现开辟了新的肿瘤治疗探索方向，即寻找选择性抑制Pol I转录的小分子药物。靶向Pol I转录对肿瘤治疗理论上有两大好处：

1）Pol I只转录47S rRNA，不对其他RNA的转录产生干扰，因此有可能最大程度地避免副作用；

2）在大多数肿瘤类型里Pol I转录异常增高，因此Pol I的选择性抑制剂有治疗多种癌症的潜力。

因此，LiveArt技术将有助于大大加快靶向Pol I抗肿瘤小分子的发现和研发。

 

浙江大学医学院博士生扶玉娟和刘亚欣为本文的共同第一作者。浙江大学医学院博士生方洁，本科生文谭烨、周子莹、陈亚龙、吴昊和顾心怡参与了本研究。浙江大学基础医学院陈宝惠研究员和转化医学研究院邹炜研究员为本文的通讯作者。本研究得到了许正平教授、盛静浩副教授、张强研究员等课题组的大力支持和帮助。本项目受到了浙江省和国家自然科学基金资助。