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Nature | 高璞/张立国/高昂等揭示环二核苷酸和叶酸的跨膜转运机制

日期:2022-10-21  浏览次数:206

来源:BioArt


环二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs是自然界中广泛且重要的信使分子。哺乳动物细胞生成一种特异的CDN:2'3'-cGAMP,其由天然免疫受体cGAS在感知细胞质异常DNA信号后催化产生【1-3】。2'3'-cGAMP结合并激活下游的接头蛋白STING,进而诱发广谱的免疫反应【4,5】。cGAS-cGAMP-STING通路的重要性已超出普通天然免疫通路的范畴,在感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、细胞自噬和衰老等方面都发挥关键作用。除了2'3'-cGAMP,病原菌分泌的多种CDN以及广受关注的CDN类抗癌药物,均可激活STING并调节免疫反应。

越来越多的证据表明,胞外的CDN发挥重要的免疫调节功能,而其中的核心问题是负电性的CDN如何穿过细胞膜进入细胞?2019年的两项工作通过在不同细胞中的全基因组筛选,鉴定了SLC19A1是关键的CDN转运蛋白【6,7】。SLC19A1不仅转运自身释放的2'3'-cGAMP,还可转运细菌分泌的CDN及人工合成的CDN药物。除了CDN,SLC19A1很早就已知是主要的叶酸和抗叶酸转运蛋白。叶酸类维生素是机体核心代谢中的一种基础性营养物质,而抗叶酸药物则被广泛用于多种癌症治疗。有趣的是,部分抗叶酸药物通过某种“神奇且未知的机制”被经常用于治疗一些自身免疫类疾病。SLC19A1由于能同时转运这两类底物,且对这两类底物的转运存在相互抑制,从而被推测可能在此过程中发挥作用。

鉴于SLC19A1在CDN、叶酸以及抗叶酸跨膜转运中的重要功能,对其底物识别机制的研究将有助于SLC19A1相关疾病的机理分析和潜在药物的开发及优化。2022年10月20日,中科院生物物理所的高璞团队、张立国团队和北京理工大学的高昂团队在Nature杂志上发表了文章Recognition of cyclic dinucleotides and folates by human SLC19A1揭开了SLC19A1识别不同底物分子的神秘面纱。

人源SLC19A1分子量较小且缺乏易识别的膜外结构域,使用冷冻电镜直接进行结构解析有较大难度。为解决这一问题,研究人员进行了大量筛选,并获得了一系列识别SLC19A1的鼠源单抗。利用其中一种刚性结合抗体,研究人员首先解析了SLC19A1向细胞内侧开口(inward-open)的无底物状态电镜结构。SLC19A1是由12根跨膜螺旋(TM)组成的MFS类型转运蛋白,此结构鉴定了SLC19A1 inward-open构象下的关键元件及分子内互作。SLC19A1底物通道内腔及胞质侧入口携带大量的正电荷,这与SLC19A1所转运底物的阴离子特性相契合。通过对已报道的功能缺失或疾病相关突变进行mapping,研究人员发现这些突变大多会影响底物运输或蛋白自身折叠。此前研究发现,连接N端和C端结构域的长柔性loop中的一段保守序列(aa 204-214)对SLC19A1至关重要,而其原因却一直未知。研究人员发现这段序列通过广泛的极性和疏水相互作用紧密嵌入TM2、3、4和11形成的口袋中,从而维持了SLC19A1整体结构的稳定和构象转变的能力。

细胞外CDN主要有三种来源:1)宿主细胞(包括肿瘤细胞)的释放;2)病原菌的分泌;3)肿瘤免疫药物的摄入。而不同来源的CDN分子,其磷酸键的连接方式(3'-5'和2'-5')及碱基的构成(如A和G)均存在不同。为全面了解不同来源及结构的CDN如何被识别,研究人员进一步解析了SLC19A1与哺乳动物内源CDN(2'3'-cGAMP)、细菌代表性CDN(3'3'-CDA)、及临床评价CDN药物(2'3'-CDAS等多个复合物inward-open状态的高分辨率电镜结构。令人意外的是,三种CDN分子都是通过形成紧密且精巧的二聚体单元结合于SLC19A1的正电荷内腔底部,而这种底物识别方式在其他SLC或MFS家族蛋白中尚未被报道。CDN二聚体单元呈现碱基在中间、磷酸糖环在两端的构象,这种特殊的组装方式依赖于两个CDN碱基间的堆叠和氢键互作,以及碱基与磷酸基团之间的氢键互作。虽然不同CDN的结合模式大致类似,但它们各自的二聚体单元却存在明显的构象差异,这反应了SLC19A1对不同CDN具有广泛的包容性。由于CDN二聚体所占据的空间相较单体更大,因此SLC19A1也得以与CDN形成了更为广泛和稳定的互作,进一步的分子动力学模拟也表明CDN二聚体单元与蛋白结合的稳定性更高。序列分析表明参与和CDN互作的氨基酸非常保守,功能实验表明其他种属的SLC19A1(如小鼠和爪蟾)也具备CDN转运能力,进一步的突变体实验明确了这些位点对CDN跨膜转运的重要作用。

为探究SLC19A1识别叶酸和抗叶酸的机制,研究人员利用一组新的鼠源单抗,成功解析了SLC19A1与5-MTHF(饮食和血液中主要存在的还原型叶酸)和PMX(一类新型抗叶酸药物)复合物的高分辨率电镜结构。有趣的是,与CDN不同,5-MTHF和PMX均以单体形式结合在SLC19A1极性腔的中上部。其中,蝶呤或吡咯并嘧啶基团插入到SLC19A1极性腔顶部的负电荷区域,而谷氨酸基团则朝向细胞内侧并触及极性腔的正电荷区域。SLC19A1参与5-MTHF/PMX互作的氨基酸非常保守,进一步的底物转运实验确认了这些位点的重要性。此前已知SLC19A1对还原型叶酸的转运效率远高于普通叶酸,研究人员发现其原因在于SLC19A1与5-MTHF的5位甲基和8位氢原子形成了额外的相互作用。

结构叠合显示,CDN与叶酸/抗叶酸占据了SLC19A1完全不同的区域,CDN的磷酸糖环与叶酸/抗叶酸的谷氨酸基团存在轻微的空间位阻。虽然结合位点不同,但两种底物都经由相同的内部通道进行转运,因此二者之间显然存在竞争性抑制。研究人员对两个底物结合口袋进行了系统性突变分析,发现有些突变会同时影响两类底物的转运,而有些突变则仅对某一类底物的转运产生显著影响,这提示后续有可能设计出具备底物抑制选择性的小分子药物。



SLC19A1转运不同底物的概念图及模式图


综上所述,该研究报道了人源SLC19A1识别CDN(多种来源)、叶酸及抗叶酸等不同底物的分子基础,揭示了其独特且多样的底物识别机制,并鉴定了SLC和MFS家族的一种全新底物识别模式。该研究为开发新一代CDN类药物和抗叶酸类药物提供了新思路,而研究中建立的抗体筛选平台及已获得的多种单抗也为抗体类药物的开发提供了基础需要指出的是,该研究中所获得的构象状态均为inward-open,并不足以阐明SLC19A1底物转运全周期的机制,后续仍需要探究SLC19A1在其他构象状态下的底物识别特点。

生物物理所博士生张启祥、生物物理所助研张旭媛、北京理工大学博士后朱亚兰和生物物理所博士生孙盼盼为本文的共同第一作者;高璞研究员、张立国研究员和高昂教授为共同通讯作者。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-022-05452-z