Cell：张宏团队揭示内质网表面钙瞬变决定自噬体在内质网形成

日期：2022-10-08　　浏览次数：3550

来源：BioArt

细胞自噬是一种溶酶体介导的降解途径。自噬指细胞通过形成双层膜结构的自噬体，包裹部分胞质并运送到溶酶体进行降解及回收的过程，对抵抗各种应激和维持细胞稳态至关重要【1,2】。自噬异常与神经退行性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。自噬体形成的关键步骤包括隔离膜（自噬体前体）的启始、成核、延伸以及闭合。对单细胞酵母中鉴定的一系列参与自噬的Atg基因的研究，促进了人们对自噬体形成分子机制的认识。这些基因编码的蛋白在自噬体形成的不同步骤发挥功能。比如自噬诱导条件下，酵母Atg17/Atg13/Atg1复合物形成凝聚体并定位在液泡膜上，进而招募下游自噬蛋白，促使隔离膜在液泡上形成【3,4】。多细胞生物自噬过程远比酵母自噬复杂，包括多个特有的步骤【5】。其中一个重要区别在于自噬体形成的位置。自噬诱导下，多细胞生物中参与自噬体起始的FIP200复合物在内质网上形成凝聚体，从而启动自噬体在内质网上形成【6】。张宏课题组前期利用建立的线虫遗传筛选模型鉴定了一系列多细胞生物特有核心自噬基因（epg基因），并发现编码的EPG蛋白参与多个多细胞生物自噬中特有的步骤【7,8】。

自噬领域中一个长期悬而未决的问题是：酵母或多细胞生物中，决定自噬体在液泡或内质网上形成的信号是什么？

2022年10月4日，中国科学院生物物理研究所张宏课题组在Cell杂志在线发表了题为 Calcium transients on the ER surface trigger liquid-liquid phase separation of FIP200 to specify autophagosome initiation sites 的研究论文。该文发现：自噬诱导条件下内质网表面的钙瞬变是决定自噬体在内质网上形成的关键信号。内质网表面的钙瞬变引起FIP200复合物液-液相分离，形成的FIP200凝聚体与内质网膜蛋白结合，定位于内质网并成为自噬体起始位点。

研究者首先发现钙离子快速螯合剂BAPTA-AM可以抑制参与自噬起始的FIP200复合物在内质网上形成凝聚体，但这一过程不能被慢速钙离子螯合剂EGTA-AM阻断。这提示快速的局部的钙离子变化，而非稳态的钙离子浓度变化，可能参与了自噬起始过程。研究人员构建了内质网跨膜结构域CYB5与快速钙离子探针GCaMP6f的融合蛋白，将GCaMP6f定位于内质网外膜表面朝向胞浆侧，以检测内质网外膜表面钙离子浓度的变化。利用多模态超分辨活细胞成像技术（Multi-SIM），研究者发现在饥饿或Torin1处理等自噬诱导条件下，内质网表面发生钙瞬变/钙振荡，且这些钙信号能被BAPTA-AM阻断（Figure 1）。

Figure 1. Multi-SIM分析不同刺激条件下钙离子浓度变化的3D曲面图。

进一步研究发现，张宏课题组前期鉴定的内质网定位的新自噬蛋白EPG-4/EI24控制内质网表面钙瞬变/钙振荡的幅值、频率和持续时间。敲除EI24的细胞中，内质网表面出现持续的钙振荡，FIP200凝聚体以及WIPI2等标记的早期自噬结构的数目显著累积。电镜观测发现这些结构显著变小而且不能闭合，提示内质网表面钙的持续增高也影响自噬体延伸及闭合的过程。通过化学试剂处理，或减小内质网表面钙通道的活性，可以降低EI24敲除引起的钙瞬变并拯救其自噬缺陷的表型。

研究发现，自噬诱导条件下，内质网表面发生的钙瞬变/钙振荡触发FIP200复合物发生液-液相分离，形成具有高度动态且易于融合的液滴状FIP200凝聚体（Figure 2）。FIP200凝聚体通过与内质网膜蛋白VAPs和ATLs结合，稳定定位于内质网上，并在内质网上移动，与其他的FIP200凝聚体融合。在达到一定大小后，FIP200凝聚体停止融合，成为内质网上的自噬体起始位点，招募下游自噬蛋白，启动自噬体的形成。研究者还发现ATG9囊泡参与调节FIP200复合物的相分离，并调节FIP200凝聚体在内质网上的空间构建。

Figure 2. (A) 内质网外膜钙瞬变触发FIP200复合物发生液-液相分离。(B) 内质网表面的FIP200凝聚体发生融合。

综上，该研究发现在自噬诱导条件下，内质网表面发生的钙瞬变诱导自噬起始FIP200复合物发生液-液相分离。形成的FIP200凝聚体通过与内质网上的膜蛋白结合而稳定定位于内质网，成为自噬起始位点（Figure. 3）。该工作揭示了内质网表面钙瞬变是决定自噬体在内质网上形成的关键信号，极大地促进了我们对多细胞生物自噬分子机制的理解。

Figure 3. 内质网外膜钙瞬变触发FIP200复合物发生液-液相分离，并定位于内质网形成自噬起始位点的模式图。

参考文献：

1. Lamb, C.A., Yoshimori, T., and Tooze, S.A. (2013). The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14, 759–774.

2. Zhao, Y.G., Codogno, P., and Zhang, H. (2021). Machinery, regulation and patho-physiological implications of autophagosome maturation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 22, 733–750.

3. Nakatogawa, H. (2020). Mechanisms governing autophagosome biogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 439-58.

4. Fujioka, Y., Alam, J.M., Noshiro, D., Mouri, K., Ando, T., Okada, Y., May, A.I., Knorr, R.L., Suzuki, K., Ohsumi, Y., et al. (2020). Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature 578, 301-305.

5. Zhao, Y.G., and Zhang, H. (2018). Formation and maturation of autophagosomes in higher eukaryotes: a social network. Curr. Opin. Cell Biol. 53, 29–36.

6. Karanasios, E., Walker, S.A., Okkenhaug, H., Manifava, M., Hummel, E., Zimmermann, H., Ahmed, Q., Domart, M.C., Collinson, L., and Ktistakis, N.T. (2016). Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nat. Commun. 7, 12420.

7. Tian, Y., Li, Z., Hu, W., Ren, H., Tian, E., Zhao, Y., Lu, Q., Huang, X., Yang, P., Li, X., et al. (2010). C. elegans screen identifies autophagy genes specific to multicellular organisms. Cell 141, 1042–1055.

8. Zhao, Y.G., Chen, Y., Miao, G., Zhao, H., Qu, W., Li, D., Wang, Z., Liu, N., Li, L., Chen, S., et al. (2017). The ER-localized transmembrane protein EPG-3/VMP1 regulates SERCA activity to control ER-isolation membrane contacts for autophagosome formation. Mol. Cell 67, 974-989.