陈玲玲团队建立基于CRISPR–Cas13的circRNA功能筛选新方法

日期：2022-07-28　　浏览次数：1479

来源：生物世界

近日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲在 Nature 子刊 Nature Protocols 上发表了题为：Screening circular RNAs with functional potential using the RfxCas13d/BSJ-gRNA system 的论文。该论文详细介绍了团队近期建立的基于CRISPR–Cas13技术的circRNA筛选新方法。

环形RNA（circRNA）是一类共价闭环的单链RNA，细胞内大多数circRNA是由mRNA前体的外显子通过反向剪接形成。除反向剪接位点（BSJ）外，circRNA在序列上与其同源的线形RNA在一级序列上完全一致，因此，在研究circRNA功能时如何将其与同源线性RNA的功能区分开来是领域中的一个难题。

基于CRISPR–Cas13技术的环形RNA功能筛选流程

2020年12月7日，陈玲玲、杨力、李劲松团队合作，在 Nature Methods 期刊发表了题为：Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system 的研究论文，开发了一种基于CRISPR-Cas13d的筛选工具，能够快速筛选和发现功能性circRNA。

该研究开发并优化了CRISPR–RfxCas13d，通过gRNA靶向circRNA的反向剪接位点（BSJ），可有效区分circRNA与线性mRNA，能够特异性敲除靶标环形RNA，而不影响其同源线性RNA的表达。

基于该技术，研究团队构建了靶向人类高表达circRNA的反向剪接位点序列的慢病毒文库，使用该筛选文库，研究团队发现了一组对细胞生长、胚胎发育等有重要作用的功能性circRNA。

基于CRISPR–Cas13在circRNA功能研究上的技术突破，陈玲玲团队受 Nature Protocols 期刊邀请详细介绍该技术的实验方法和流程，以期推动该技术在circRNA功能研究领域的应用。

在该实验方法中，研究团队详细描述了针对circRNA BSJ位点的gRNA文库设计和构建，RfxCas13d稳定表达细胞系构建，细胞水平和体内水平的功能性circRNA筛选以及筛选结果的计算分析流程等等。同时还对实验过程中可能遇到的问题以及注意事项进行了详细阐明。该方法不仅为circRNA的功能研究提供助力，也为深入理解circRNA奠定新的技术基础。

中科院分子细胞卓越中心原副研究员李斯琪、副研究员乌皓为论文共同第一作者，陈玲玲研究员为论文通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41596-022-00715-5

https://www.nature.com/articles/s41592-020-01011-4