Cell丨许瑞明/张志国合作组解析催化H3K56乙酰化的分子机制——李晴教授解读背后的故事

日期:2018-07-27  浏览次数:263

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H3K56乙酰化和H3K27、H3K9位点的乙酰化最大不同之处在于它所处的位置位于核小体组蛋白H3的球形结构(globular domain)而非常见的尾部。尽管十年前,当时在Mayo Clinic的张志国教授课题组率先报道了催化H3K56ac的酶Rtt109,后来发现Rtt109-Asf1才是H3K56乙酰化催化的复合体,但是因为各种原因以及面临的困难,Rtt109-Asf1与H3-H4组蛋白二聚体的结构一直没有解析。7月26日,中科院生物物理所许瑞明课题组与哥伦比亚大学张志国教授课题组合作在Cell发表题为Multisite Substrate Recognition in Asf1-Dependent Acetylation of Histone H3 K56 by Rtt109的研究论文,率先获得了Rtt109-Asf1-H3-H4复合物结构,解析了催化H3K56乙酰化的分子机制。这个工作有什么重要的科学意义?面临难点在哪?为什么做了长达十年之久?BioArt有幸邀请到了北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李晴研究员针对上述问题给出了详细的解答和点评,以飨读者!




责编丨迦  溆

撰文/点评丨李 晴(北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心研究员,国家“杰青”)


染色质的基本单元核小体由约147bp DNA缠绕组蛋白八聚体核心组成。该组蛋白八聚体包括一个H3-H4四聚体和两个H2A-H2B二聚体。组蛋白的翻译后修饰可以塑造染色质的状态,是一类重要的表观遗传修饰,和DNA的复制、转录及损伤修复密切相关。


本世纪前十年随着质谱技术的发展,人们寻找组蛋白新修饰的热情空前高涨,一个新的修饰和一个新的酶的发现会让整个领域为之振奋。H3K56Ac有别于其他位点的乙酰化修饰,这是一个位于核小体内部的球形区修饰,它的发现是表观遗传领域的一个小高潮。围绕H3K56Ac修饰,众多科学家致力于揭示该修饰的功能,寻找该修饰相关的因子,并解析其结构解释其发挥作用的分子基础。


在进入正题前,先说说发现Rtt109的趣闻。适逢其会,我博后期间加入Mayo Clinic 张志国教授的实验室,参与H3K56Ac在染色质的复制中作用,同时了解了催化该修饰的酶的发现过程。张志国教授实验室从纯化染色质组装因子CAF-1入手,通过质谱的方法寻找染色质组装过程中新的修饰,但是他们鉴定出组蛋白H3赖氨酸56位存在修饰,不过囿于当时质谱鉴定技术的局限,无法确定修饰的类型,实验室走了一段弯路,花了很长一段时间围绕甲基化修饰展开研究,一直没有进展,后来才意识到可能是乙酰化修饰。


当时,领域内的竞争也非常激烈,Michael Grunstein实验室先报道了发现了这个修饰的存在,并推测乙酰化酶是Spt10(Cell,2005)【1】;差不多同一时间,Alain Verreault实验室也报道鉴定出H3K56Ac的存在,并发现去乙酰化酶是Hst3/Hst4(Nature,2005)【2】; 第一轮的竞争中,张老师实验室慢了一些,他们的工作次年才发表(Biochemistry,2006)【3】。但是在H3K56Ac修饰酶的鉴定过程中,张老师和当时的博士后韩俊宏(现在是四川大学教授,长江学者)率先发现Rtt109 是H3K56的乙酰化转移酶(Science,2007)【4】,这一切得益于两只神奇的兔子,他们获得了高质量的H3K56Ac的抗体。


最开始一直使用经典的生化手段寻找催化H3K56Ac的酶,可是实验并不成功,尽管Grunstein组推测Spt10是催化H3K56的乙酰化酶,可是张老师实验室利用自己纯化的H3K56Ac的抗体分析当时已知的所有乙酰化酶突变体,并没有发现明显的H3K56Ac水平降低,说明这些都不是真正的H3K56的乙酰化酶,实验一时陷入僵局。改变思路,他们利用dot blot的方法在酵母约6000个突变体寻找H3K56Ac水平消失或改变的点(图1),得益于那两只神奇的兔子及韩俊宏的一双巧手,经过一番艰苦的努力,他们最终发现有两个杂交信号在dot blot膜上消失了,两个信号对应的基因,一个是Asf1,一个是Rtt109



已经知道Asf1是很重要的H3-H4分子伴侣,难道Rtt109,这个功能未知的蛋白,是H3K56乙酰化酶?序列分析表明Rtt109没有任何已经的乙酰化酶序列特征,经过严密的体内体外分析,张老师和韩俊宏证明Rtt109确实是神秘的H3K56Ac的修饰酶


许瑞明教授主要工作围绕表观遗传的结构机理展开,探索各种组蛋白修饰酶的催化的分子机制,组蛋白修饰的识别,染色质的高级结构的建立和维持的结构基础。许瑞明老师和张志国老师建立了长期的合作,特别是在Rtt109一系列相关的研究,从2007年Rtt109发现开始,许老师和张老师实验室就一直致力于解析这个酶的结构和催化特征。序列分析表明,Rtt109在真菌中非常保守,但是在高等生物中并没有序列保守的同源基因。而且和其他已发现的乙酰化酶不同,Rtt109催化的底物发生在H3K56Ac区域,属于球形区域(globular domain),这跟以往发现的灵活的N端尾巴修饰并不一样;另外, Rtt109的催化活性需要Vps75或者Asf1的协助, Vps75或者Asf1可以提高约100倍Rtt109的酶活


为了阐明Rtt109催化H3K56Ac修饰的分子机制,科学家作了很多探索,先后解析了Rtt109、Rtt109-AcCoA、Rtt109-Vps75等的结构,发现Rtt109虽然和已知的组蛋白乙酰化酶的蛋白序列没有相似性,但它们的三维结构却类似,且还是不能明白Rtt109催化H3K56位乙酰化的分子机制。而且体内外实验证据表明Rtt109-Vps75主要催化H3K9和H3K27的乙酰化,Rtt109-Asf1才是H3K56乙酰化催化的复合体,但是Rtt109-Asf1-H3-H4 的结构一直没有解析,其困难在于Rtt109-Vps75是一个稳定的复合体,而Rtt109 和Asf1没有直接的相互作用,难以拿到可以用于结晶的复合体,而且还要避免Vps75的干扰。随着2011年几个实验室(包括许瑞明和张志国实验室)解析了Rtt109-Vps75的结构,围绕Rtt109相关的结构研究陷入低潮,直到今天许瑞明老师和张志国老师课题组合作才最终解析了Rtt109-Asf1-H3-H4这个大复合物。


Rtt109-Asf1-H3-H4复合物结构是染色质领域第一个酶和全底物的复合物,而非多肽。许瑞明和张志国合作组巧妙的选择烟曲霉A.fumigatus 的Rtt109(AfRtt109),相较于酿酒酵母的Rtt109(ScRtt109),AfRtt109缺乏α2和β5之间的约60-70个氨基酸残基,消除了AfRtt109 和ScVps75的相互作用,但不影响形成Rtt109-Asf1-H3-H4复合物。


在这个3.5 Å分辨率的复合物中,我们可以看到全部的H3-H4二聚体结构,看到Rtt109和H3-H4相互作用的分子机制,也可以看到Asf1在Rtt109催化H3K56乙酰化中的功能。和Rtt109-Vps75的“电话听筒”2-2结构不同,Rtt109-Asf1-H3-H4形成异源三聚体结构,H3-H4位于Asf1和Rtt109之间(图2)。

和以往解析的组蛋白乙酰化酶的结构相比,Rtt109-Asf1-H3-H4异源三聚体结构有几点出乎意料:1,在核小体八聚体结构中,组蛋白H3K56是位于alpha N helix中,而在Rtt109-Asf1-H3-H4复合物中,alpha N helix结构消失,helix被完全打开,形成舒展的伸长结构状态,通过和H4和Rtt109相互作用而稳定,将H3K56递送到Rtt109的催化活性区;2,尽管Asf1是Rtt109催化H3K56Ac必须的,但是Asf1和Rtt109之间几乎没有直接的相互作用,原本无序的H4 C端在Asf1 C端介导下形成的反平行β结构稳定结构,进而和Rtt109发生相互作用。这样Asf1并没有直接参与在Rtt109的H3K56Ac的催化反应,而是通过稳定组蛋白H4的C端,使组蛋白H3-H4与Rtt109的结合更加稳定,保证酶和底物更加契合。这点不同于传统的组蛋白分子伴侣护送(escort)作用,而且改变了组蛋白的结构,使之发挥相应的功能。另外,Rtt109-Asf1-H3-H4复合体中的H3-H4的结构也不同于它们在核小体中的结构,也许有助于它们结合CAF-1和Rtt106这两个DNA复制相关的组蛋白分子伴侣,也许在辅助核小体“呼吸”过程中发挥作用。


Rtt109-Asf1-H3-H4复合物结构的解析第一次获得了Rtt109催化H3K56乙酰化的分子机制,揭示了Asf1在此过程中的作用,发现了一种新的组蛋白乙酰化修饰机制,有助于理解染色质修饰酶和底物的相互作用以及催化的复杂机制。而且Rtt109-Asf1-H3-H4复合物解析进一步表明除了反应催化结构域和底物结合结构域对于酶促反应非常重要外,辅助因子和酶调节底物的结构,对于稳定酶和底物间的相互作用,维持催化反应高效进行也是非常重要的。鉴于Rtt109在真菌中非常保守,对真菌的生长非常重要,而且没有高等多细胞真核生物的序列同源蛋白,所以Rtt109也是热点的抗真菌药物的靶点。这一结构的解析显然对发展抗真菌药物有重要的指导意义!

论文通讯作者许瑞明研究员(左)和张志国教授(右)