Chem Sci︱MoTag: 实时监测、鉴定活细胞蛋白质聚合的新方法

日期：2018-06-20　　浏览次数：6353

   原创： 马国林

   蛋白质是生物体器官、组织、细胞的重要组成成分，也是细胞一系列活动及功能的执行者。人体内大约三分之一的蛋白质是以二聚体或更高级别的多聚体（三聚体、四聚体等）形式存在的，它们必须聚合为多聚体才能执行其生物功能。例如在血液循环中，血红蛋白必须形成四聚体才能发挥运输氧气的功能，而异常血红蛋白病通常是由氨基酸突变引起的四聚体结构不稳定，形成单体或者聚集成为包涵体、丧失运输氧气的功能，因此导致疾病的发生。

   最近德州A&M大学（Texas A&M University）Dr. Yubin Zhou教授课题组发明了一种新的方法，可以在活细胞内实时监测蛋白质的聚合状态，研究蛋白质结构与活性的关系，以及蛋白质与蛋白质/DNA/配体的相互作用。“我们首先筛选出一段含有12个氨基酸的肽段MoTag (monomer/oligomer detection tag)，MoTag和荧光蛋白（GFP或者mCherry）一起，可以在活细胞中通过荧光显微镜鉴定出目标蛋白的聚合状态（图1）”，周教授介绍道。“虽然目前有一些方法，如尺寸排阻色谱法、非变性蛋白质电泳、核磁共振等，可以在水溶液中鉴定蛋白质的聚合状态，但是这些溶液中的方法通常需要经过复杂繁琐的蛋白质表达纯化过程，耗时常达数周到几个月，并且蛋白在溶液中所处的环境有别于细胞中的天然环境，因此检测到的聚合状态很可能与天然环境中的状态不同。我们的新方法能有效地解决上述问题。”

   微管是细胞骨架的重要组成部分，有些蛋白质通过结合微管参与细胞器的运输、细胞质的重排和细胞的流动等过程。这些微管相关的蛋白通常共有保守的功能区域，如微管结合区域和螺旋聚合区域（coiled-coil domain），其中螺旋聚合区域主导的二聚或者多聚对这些蛋白质结合微管至关重要。因此，理论上存在这样一段微管结合区域，在连接有荧光探针的情况下，能够在活细胞中区分蛋白质的聚合状态。“我们筛选优化了数十个微管相关的蛋白或者结合区域，构建和试验了上百个质粒，最后得到MoTag这一与微管间接结合12AA 的小肽段。新方法只需将MoTag连接到目标蛋白，然后将构建好的质ac粒转染到细胞中（如HeLa），次日（12 h – 16 h）在荧光显微镜下根据荧光成像的形貌（与微管结合的强弱），就能够区分蛋白质单体、二聚体、三聚体还是四聚体的状态（图2）”，该工作的第一作者同时也是通讯作者的马国林博士指出。

图1.下图：示意图阐述MoTag(●) 连接聚合蛋白()与微管的结合(●●)；上图：荧光显微镜图片显示MoTag连接的二聚体（左）和四聚体（右）蛋白在连接有绿色荧光蛋白时形貌。

图2. 不同聚合状态的蛋白与微管结合的强弱与其聚合状态成正比例关系

   该方法的另一合作教授Dr. Yun Huang补充道：“应用MoTag，我们分析了一系列不同聚合状态的蛋白质，这些蛋白质的聚合状态与微管的结合的强度成正比（图3）；同时我们应用MoTag剖析了肿瘤抑制因子p53蛋白（四聚体）的结构与活性关系，以及p53与DNA 的相互作用。此外，MoTag也能很好地响应配体结合导致蛋白聚合的反应，如Rapmycin诱导的FRB-FKBP的二聚，以及钙离子结合-解离导致EF-SAM区域的解聚-多聚的反应。这些现象很好地说明了MoTag潜在的广泛应用”。

   随着年龄的增长，蛋白质错误折叠或者突变的概率在逐渐增加，这个过程常常导致癌症、老年痴呆症、帕金森症等疾病的发生。“MoTag可以在活细胞内实时反映蛋白质的聚合状态，能够迅速指示蛋白质是否正确折叠，因此临床上将来可用于监测疾病关联的蛋白质、作为标志物监测疾病的发生、发展。另外，MoTag也可以发展成为活细胞水平针对聚合蛋白的高通量药物筛选平台”。周教授在谈到MoTag后续的应用、开发和推广时这样说。“我们的方法步骤简便、结果简洁明了，可应用于任何拥有标准荧光显微镜配置的实验室，特别适合生物化学、化学生物学和蛋白质化学等实验室，来研究蛋白质的结构与功能关系。

   该工作最近在Chemical Science发表，题为“Genetically encoded tags for real time dissection of protein assembly in living cells" 。该文被英国皇家化学学会期刊主编推荐为精选热门文章，并配专题新闻报道（参见延伸阅读）：Ma et al., Chem Sci, 2018, Accepted Manuscript, DOI: 10.1039/C8SC00839F

   延伸英文科普阅读：

   Unfolding clues to combat disease:

   http://www.rsc.org/news-events/journals-highlights/2018/jun/protein-folding/

   For Better Diagnosis, Watch Proteins Fold in Real-Time:

   http://www.frontlinegenomics.com/news/23660/for-better-diagnosis-watch-proteins-fold-in-real-time/

   https://www.futurity.org/misfolded-proteins-motags-diseases-1779802/

   http://www.thebatt.com/science-technology/gene-control-with-a-flick-of-a-switch/article_d6ec715a-6ddc-11e8-b101-47bd88488bf8.html

   https://vitalrecord.tamhsc.edu/a-new-way-to-diagnose-diseases/